Vendredi 7 mai 2004
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Les cours de l'option Biologie Moléculaire I
Table des matières
1 L'organisation de la Cellule (12 heures)
Keith Dudley
1.1 Aperçu général sur le monde vivant. Notion de classification des êtres vivants
Une introduction : les organismes unicellulaires-surtout des bactéries-et le développement
des organismes multicellulaires. L'idée que l'organisation de base d'une cellule a été
conservé pendant l'évolution. L'avantage d'être multicellulaire. Les organismes de choix
pour analyser comment fonctionne une cellule : bactérie, nématode, mouche, souris.
Pourquoi pas les études sur l'homme ?
1.2 La structure de la cellule: eucaryote et procaryote
L'idée d'une membrane pour permettre aux cellules de trier les molécules. La présence des
organites-mitochondries, Golgi, ribosomes-adaptés pour des fonctions spécifiques dans la
cellule. La présence d'un noyau chez des eucaryotes et l'absence chez des
procaryotes-pourquoi ? Notion de la métabolisme : la synthèse et la dégradation des
molécules et l'importance de l'énergie chimique dans la cellule.
1.3 Vue générale sur la structure des macromolécules:protéines et acides nucléiques
La structure des protéines ; l'idée que l'ordre des acides aminés donne à une protéine des
caractéristiques uniques. Autour de 10 000 protéines dans une cellule avec beaucoup de
fonctionnes différentes : structurelle, enzymatique, régulatrice.
La présence dans toutes les cellules de 2 types d'acide nucléique : désoxyribonucléique
(ADN) et ribonucléique (ARN). La simplicité de leur structure par rapports aux protéines.
La présence de 4 sous unités (nucléotides) dans chacun de ces macromolécules. L'idée que
l'ordre des nucléotides donne à une cellule toutes ses caractéristiques.
1.4 L'information génétique: du gène à la protéine (transcription et traduction)
Toute l'information pour la production de toutes les molécules dans la cellule est
présente dans l'ADN. L'ADN chez des eucaryotes est en combinaison avec des protéines qui
s'appellent les histones sous formes des chromosomes. Chez des bactéries il existe un seul
chromosome qui est circulaire. l'ADN est copié en ARN-la transcription-et la séquence des
nucléotides est lue dans le cytoplasme par des ribosomes pour produire les protéines-la
traduction. Une explication de la mécanisme de base de la transcription et de la
traduction et l'idée de mutation. La différentiation d'une cellule ( les cellules de foie
sont différents par rapport aux cellules du cerveau, par exemple) s'explique par la
capacité d'une cellule de décider quelles séquences d'ADN sont transcrits.
1.5 Le gène procaryote et le gène eucaryote
Un gène peut être divisé en deux parties : des séquences régulatrices qui ne sont pas
transcrites et les séquences codantes qui sont transcrites. L'idée qu'une interaction
entre les séquences régulatrices et les protéines qui s'appellent les facteurs de
transcription est essentielle pour avoir la transcription d'un gène. La présence des
introns chez des gènes eucaryotes et l'épissage. La possibilité de produire 2 protéines
différentes à partir d'un seul ARN par épissage alternatif. L'importance de la membrane du
noyau pour trier des molécules qui entrent dans le noyau. La transcription et la
traduction peuvent se faire en même temps chez des bactéries grâce à l'absence d'un noyau
- l'avantage pour des bactéries.
1.6 La structure du génome
La taille du génome humain est 1000 fois la taille du génome d'une bactérie. Chez des
bactéries tout l'ADN est codant. Les séquences non-codantes existent dans le génome de
tous les eucaryotes. Chez l'homme 10séquences présentes dans le génome. Les séquences répétées-plusieurs familles différentes
de différentes tailles et avec jusqu'à 500 000 copies par génome. L'évolution de ces
séquences et leur importance pour le génome. La présence des familles de gènes : des
séquences qui codent pour des protéines semblables mais avec des fonctions spécifiques
dans la cellule. La famille des gènes globines et la famille des gènes doigt à zinc, par
exemple. L'évolution de ces familles. |
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1.7 Documents pédagogiques
2 Les Méthodologies de Biologie Moléculaire (8 heures)
Sophie Blevès
2.1 Le clonage et les vecteurs de clonage
Pour analyser la séquence ou la fonctionne d'une molécule d'ADN il faut plusieurs millions
de copies de cette molécule. Commençant avec une seule molécule on peut produire par
clonage un nombre illimité de la même molécule. La multiplication dépend de l'insertion de
l'ADN dans des plasmides ou les virus (ce sont des vecteurs) et la réplication de ces
molécules recombinantes chez des bactéries. Le clonage est possible grâce aux enzymes de
restriction, qui coupent l'ADN d'une manière très spécifique, et les ligases qui relient
les molécules d'ADN.
2.2 La préparation des banques d'ADN (cDNA, génomique)
L'ADN génomique - l'ADN dans le noyau-est isolé et coupé avec un enzyme de restriction.
Tous les fragments d'ADN sont inserés individuellement dans un vecteur pour produire
plusieurs millions de molécules recombinantes. Ces molécules sont propagées chez des
bactéries pour produire les clones. Toutes les séquences présentes dans le génome sont
présentes parmi les clones. Ensemble cette population de bactéries s'appelle un banque
génomique (Genomic Library en anglais).
Parfois on s'intéresse uniquement aux ARN messagers présents dans une cellule. Ces ARN
sont isolés et transformés en ADN par la transcriptase inverse. Les cDNA (copy DNA) sont
clonés dans un vecteur et puis les molécules recombinantes sont introduites dans des
bactéries. Ici il s'agit d'une banque cDNA (cDNA library en anglais).
2.3 Les sondes et l'hybridation
Les séquences des acides nucléiques font des appariements Watson et Crick quand des
séquences sont complémentaires et anti-parallèle. Ca s'appelle l'hybridation. Pour
détecter la présence d'une séquence dans une banque d'ADN il faut ajouter la séquence
complémentaire marquée avec une nucléotide radioactif et par hybridation cette
séquence-une sonde-va se fixer sur le clone présent dans la banque. On peut faire la même
chose avec des séquences fixées sur les membranes, le Northern (ARN sur la membrane) ou
Southern (ADN sur la membrane). L'interaction peut être ADN-ADN, ADN-ARN, ou ARN-ARN. En
principe une sonde de 17 nucléotides est spécifique dans le sens que la possibilité que la
même séquence existe 2 fois dans le génome est presque zéro. Tous les techniques de
biologie moléculaire dépend de l'hybridation.
2.4 Analyse des molécules par Southern et Northern blotting
Le blotting c'est le transfert des acides nucléiques, séparés par taille sur un gel
d'agarose, sur une membrane, soit Nylon soit nitrocellulose. Pour le Southern il s'agit de
faire migrer les fragments de restriction d'ADN sur un gel, de faire le transfert sur la
membrane et d'ajouter une sonde. Le patron d'hybridation fournira des informations sur la
structure du gène. Pour le Northern on fait pareil avec des ARN et on ajoute une sonde
spécifique pour savoir si le gène s'exprime dans un tissu, et la taille des transcrits.
2.5 Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR)
La réaction PCR permet l'amplification des séquences d'ADN utilisant des primers-amorces-
qui sont spécifiques pour un gène. La réaction est en 3 parties : l'ADN double brin est
dénaturé à 95°C, les amorces se fixent à 55°C et l'ADN est synthétisé à 72°C. Le cycle est
répété entre 30 et 40 fois. On utilise un ADN polymérase thermostable-la Taq polymérase.
Le PCR a bouleversé le monde de biologie moléculaire. C'est utilisé pendant le clonage,
pour le dépistage des maladies, pour détecter des virus qui se cachent dans le génome et
pour la mutagenèse entre autres. Très sensible : 1ug d'ADN génomique est mis dans une
piscine olympique. On peut détecter la présence de la séquence par PCR !
2.6 Séquençage
Le séquençage est fondamental pour comprendre la fonction d'un gène. C'est facile de
séquencer l'ADN et beaucoup plus difficile de séquencer une protéine. Avec la séquence
d'un gène on peut prédire la séquence des acides aminés codés par le gène et avoir une
idée sur la fonction de la protéine. Le génome de plusieurs organismes a été déjà
séquencé. Le séquençage est très automatisé maintenant mais la réaction de base reste la
même : on synthétise l'ADN dans la présence des terminateurs-les dideoxynucleotides -
produisant des fragments emboîtés qui sont ensuite séparées par taille sur un gel .
2.7 Documents pédagogiques
3 Le noyau (8 heures)
Dominique Charmot et Keith Dudley
3.1 La réplication de l'ADN
L'importance d'avoir un seul tour de réplication du génome avant la division cellulaire.
Les caractéristiques de l'enzyme ADN polymérase et les autres protéines essentielles pour
assurer la réplication. La correction sur épreuves et l'importance pour limiter le nombre
d'erreurs qui surviennent pendant la réplication. L'idée d'un origine de réplication. Une
appréciation de la complexité de la réplication chez l'homme : il faut répliquer 3000 000
000 nucléotides (2 mètres d'ADN) sans faute dans une période courte (2-3 heures), et il
faut que chaque séquence soit répliquer une seule fois.
3.2 La mitose et la méiose
La réplication des chromosomes dans une cellule s'appelle la mitose. Pendant la mitose la
membrane du noyau disparaît, le génome est dupliqué et les deux jeu de chromosomes sont
répartis entre deux nouveaux noyaux. A la fin il faut que chaque noyau contient le même
nombre de chromosomes que le noyau d'origine : un chromosome de plus ou de moins est
létale pour la cellule. La mitose est suivie par le cytocinèse, la division du cytoplasme
et les organites.
Deux choses doivent se faire pendant la méiose : la recombinaison entre les chromosomes
d'origine maternel et paternel et la production des cellules-des gamètes-qui contiennent
la moitié de l'information génétique présentes dans les cellules somatiques. L'ADN est
dupliqué une fois ( 4n) et ensuite il y a 2 divisions 'mitotiques' pour produire à la fin
des cellules haploïdes (n). Après la fécondation d'un ovocyte par un spermatozoïde on
produit encore une fois une cellule diploïde, 2n.
3.3 L'hérédité et la carte génétique
Chez des eucaryotes le génome est réparti sur plusieurs chromosomes : 46 chez l'homme, 40
chez la souris. Pour identifier les gènes qui sont impliqués dans le développement des
maladies il faut une idée sur la localisation des gènes sur les chromosomes. Avec le
séquencage du génome humain on va savoir la position de chaque gène dans le génome. Avec
des maladies génétiques on peut suivre l'héritage des séquences dans une famille dans le
but de faire un lien entre la présence d'une séquence et le développement d'une maladie.
Souvent la séquence qui est toujours présentes chez des personnes atteints ne joue aucun
rôle dans le développement de la maladie, mais elle est très proche sur le chromosome. Les
gènes qui se situent à coté de cette séquence - connus grâce au séquençage du génome -
sont des gènes candidats pour la maladie.
3.4 Documents pédagogiques
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